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實(shí)驗指南

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WB實(shí)驗操作流程

2022-06-20
414次

WB 實(shí)驗步驟

一、樣本制備

1、細胞收集

1.1、貼壁培養細胞收集:去除貼壁細胞的培養液,用預冷 PBS 清洗細胞 2 次,吸出 PBS。

1.2、懸浮培養細胞收集:先 3000 轉/min 離心 5 分鐘收集細胞沉淀,再用預冷 PBS 輕輕吹打重懸,離心收集細胞沉淀。

1.3、組織樣本收集:用干凈的醫用剪剪碎目標組織,使組織塊盡量小,此操作最好在冰上進(jìn)行,并且應盡快完成,以防止樣品被蛋白酶降解。將組織用液氮或超低溫冰箱中冷凍 30min,迅速用液氮研磨,研磨過(guò)程盡量控制在 1-2min 之內,以減少蛋白的降解。

2、總蛋白提取

2.1、細胞/組織裂解:對于細胞樣本,加入預冷的 RIPA 裂解緩沖液(含有 PMSF)(每 107 細胞/100 mm 培養皿/150cm2 培養瓶加入 1ml;每 5×106 細胞/60 mm 培養皿/75cm2 培養瓶加 0.5ml),冰上裂解 15min。

對于組織樣本,按照 1mL 裂解液/100mg 組織向勻漿器中加入蛋白裂解液,多次勻漿,直至組織完全勻漿,收集勻漿液。(裂解液中根據需要選擇添加或不添加蛋白酶抑制劑)。

2.2、離心

把裂解好的樣本置于于預冷的高速冷凍離心機中,12000rpm,10min。

2.3、蛋白變性

離心完成后,棄去沉淀,保存上清。吸取 10μl 蛋白上清做蛋白濃度(BCA 法)測定。向剩余的蛋白提取液的離心管中加 5×Loading Buffer(最終工作液為 1X),95℃加熱變性 5min,待液體完全冷卻后置于-20℃分裝保存,避免反復凍融。

二、凝膠電泳

1、制膠及上樣:

1.1、配制分離膠,根據蛋白大小,選擇不同濃度的分離膠(見(jiàn)下表)混勻后注入預先按照好的制膠器中,其上加一薄層異丙醇封膠,室溫水平靜置 30min 至凝固。聚合后,可見(jiàn)在頂層異丙醇與凝膠的界面間有一清晰的折光線(xiàn)。注意:防止氣泡注入;注膠前加入 TEMED,防止注膠前凝固;注入異丙醇時(shí)需沿玻板一邊緩慢拖動(dòng)加入。

1.2、待分離膠凝固后,傾去其上的異丙醇,以吸水紙吸凈殘余液體,緩緩加入配制好的濃縮膠至玻璃平板夾層, 將樣品梳沿玻板一端緩慢插入夾層的濃縮膠液體中,必要時(shí),再補加濃縮膠液體充盈剩余空間。室溫水平靜置 30min, 待膠完全聚合,凝膠時(shí)間視溫度而定。注意樣品梳與膠溶液間避免產(chǎn)生氣泡。

1.3、將凝膠固定于電泳裝置上,內槽加滿(mǎn)電泳緩沖液,外槽沒(méi)過(guò)底部 3-5cm 即可。雙手垂直拔出樣品梳。

1.4、用移液槍吸取樣品垂直梳孔上樣。成分很復雜的蛋白質(zhì)混合物需加 100~200μg,而成分較少的樣本只需 1-50μg 蛋白量。對照孔加入蛋白質(zhì)分子量標準品,如有空置的加樣孔,須加等體積的空白 1×Loading Buffer,以防相鄰泳道樣品的擴散。

分離膠濃度的選擇:

分子量( kDa

分離膠濃度

X≤10

15%

10<X≤15

13.5%

15<X≤25

12%

25<X≤35

11%

35<X≤40

10%

40<X≤55

9%

55<X≤70

8%

70<X≤100

7%

100<X

6%

2、電泳(采用恒壓)

2.1、接通凝膠電泳儀的電源,先在 80V 下電泳至溴酚藍染料從濃縮膠進(jìn)入分離膠。(約 30 分鐘)

2.2、提高電壓至 120V,繼續電泳直至溴酚藍到達凝膠底部為止。

三、轉膜

1.1、從玻璃板中取出凝膠,在凝膠的一角切去一小塊以便在染色及干膠后仍能認出加樣次序,將其浸泡于轉移緩沖液中。

1.2、取與膠同樣大小的 NC 或 PVDF 膜,NC 膜用轉移緩沖液浸泡 5 分鐘以上待用,PVDF 膜需要先放入甲醇中浸泡5-10 分鐘,再放入轉移緩沖液浸泡。

注意:目的蛋白分子量大于 20kDa 選擇 0.45μm 的NC 膜,小于 20kDa 選擇 0.2μm 的NC 膜或 0.22μm 的PVDF 膜。

1.3、按從負極到正極順序在轉移夾內依次放置預先經(jīng)轉移緩沖液浸泡的海綿、三層濾紙、凝膠、膜、三層濾紙、海綿,保證每層之間沒(méi)有氣泡。

1.4、將轉移夾放入預先加滿(mǎn)轉移緩沖液的轉移槽中,膜在正極、膠在負極,整個(gè)轉移槽放置入冰水浴中,按照下表條件進(jìn)行電泳。

注意:事先裁剪濾紙和膜,1 張膜和 6 張濾紙??磕ひ粋葹V紙可裁剪稍小些,以防與另一側濾紙邊緣連接形成短路。轉膜條件的選擇:

分子量( kDa

轉膜條件

X≤10

恒流 200mA, 30min

10<X≤15

恒流 200mA, 40min

15<X≤20

恒流 200mA, 50min

20<X≤50

恒流 200mA, 1kDa/min+20min

50<X≤100

恒流 200mA, 1kDa/min+30min

100<X≤150

恒流 250mA, 1kDa/min+20min

150<X≤180

恒流 270mA,1kDa/min

180<X

恒流 270mA,1kDa/min

四、封閉

把膜取出后放入合適孵育容器中,加入 5%脫脂奶粉/TBST,室溫搖動(dòng)孵育 1 小時(shí)。

五、抗體孵育

1、一抗孵育:直接將一抗加入封閉液中進(jìn)行適當稀釋?zhuān)覝?2h 或 4℃振搖孵育過(guò)夜;

2、以 TBST 洗膜,5 分鐘 x 4 次;

3、二抗孵育:二抗用 TBST 稀釋?zhuān)覝叵抡駬u孵育 1h;

4、以 TBST 洗膜,5 分鐘 x 4 次。

注意:清洗換液過(guò)程中應避免膜干掉,否則會(huì )產(chǎn)生非特異背景。

六、曝光

1、根據膜的大小,按每 10cm2 膜使用 1-2ml 工作液,將 ECL 試劑盒中的 A、B 組分按 1:1 的比例混合,配置成發(fā)光檢測工作液。

2、用鑷子取出膜,膜下緣輕輕接觸吸水紙,去除膜上多余液體,將工作液加到膜上,室溫孵育 1-2min,此步驟可在潔凈保鮮膜上完成。

3、壓片檢測:將膜固定于片夾內,暗室壓片 1 分鐘,立即顯影定影,根據結果調整壓片時(shí)間,或直接分別壓片 30s、1min、3min、5min,然后一起顯影定影觀(guān)察結果。

4、熒光成像儀檢測:將膜放到熒光成像儀內,參考儀器說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測。


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