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ELISA實(shí)驗中如何精確判斷顯色時(shí)長(cháng),TMB顯色

2022-06-20
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監控OD620數據精確控制TMB顯色法

原理:

TMB顯色劑主要成分是二,二甲基聯(lián)苯胺(非致癌HRP底物),氧化失去電子后變成電子轉移復合物(TMB+TMB,復合物最大吸收峰652nm(藍色),當加入酸性物質(zhì)后導致電子轉移復合物質(zhì)子化,迫使兩者分離出一分子的TMB(無(wú)色),一分子TMB+(黃色琨,最大吸收峰450nm),同時(shí)酸性條件下HRP酶失活,顯色停止。

因此652的數據正向對應450的數據,(實(shí)驗室使用620nm相對652誤差10%)。

監控的OD620(藍色)和終止后對照450表格

部分項目顯色控制情況:

顯色控制,精確計算注意事項:

1、酶標儀讀取TMB+
450nm
的最佳設備分辨率是3.0以下,在2.2以下有非常好的線(xiàn)性(2倍關(guān)系)。如果是定量,顯色不易過(guò)深,參考數據為Thermo FC酶標儀提供。注意:不同廠(chǎng)家的酶標儀靈敏度存在差異。

2、使用專(zhuān)業(yè)的曲線(xiàn)軟件,推薦軟件可以在菲恩網(wǎng)站下載(技術(shù)支持-下載),如果是拋物線(xiàn)建議使用四參數方程(MMF)計算。

3、顯色過(guò)深后(OD4503.5),TMB+濃度較高,其溶解性大大低于TMB,會(huì )緩慢形成結晶并沉淀在孔底部(黑色針狀顆粒),黃色會(huì )消退,應立即讀數。過(guò)深的顯色會(huì )在12小時(shí)后在孔底部出現大量黑色結晶,而無(wú)法保留黃色。


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