監(jiān)控OD620數(shù)據(jù)精確控制TMB顯色法

原理：

TMB顯色劑主要成分是二,二甲基聯(lián)苯胺（非致癌HRP底物），氧化失去電子后變成電子轉(zhuǎn)移復(fù)合物（TMB+和TMB）,復(fù)合物最大吸收峰652nm（藍色），當(dāng)加入酸性物質(zhì)后導(dǎo)致電子轉(zhuǎn)移復(fù)合物質(zhì)子化，迫使兩者分離出一分子的TMB(無色)，一分子TMB+(黃色琨，最大吸收峰450nm)，同時酸性條件下HRP酶失活，顯色停止。

因此652的數(shù)據(jù)正向?qū)?yīng)450的數(shù)據(jù)，（實驗室使用620nm相對652誤差10%）。

監(jiān)控的OD620（藍色）和終止后對照450表格

部分項目顯色控制情況：

顯色控制，精確計算注意事項：

1、酶標(biāo)儀讀取TMB+
450nm的最佳設(shè)備分辨率是3.0以下，在2.2以下有非常好的線性（2倍關(guān)系）。如果是定量，顯色不易過深，參考數(shù)據(jù)為Thermo FC酶標(biāo)儀提供。注意：不同廠家的酶標(biāo)儀靈敏度存在差異。

2、使用專業(yè)的曲線軟件，推薦軟件可以在菲恩網(wǎng)站下載（技術(shù)支持-下載），如果是拋物線建議使用四參數(shù)方程（MMF）計算。

3、顯色過深后（OD450＞3.5），TMB+濃度較高，其溶解性大大低于TMB，會緩慢形成結(jié)晶并沉淀在孔底部（黑色針狀顆粒），黃色會消退，應(yīng)立即讀數(shù)。過深的顯色會在12小時后在孔底部出現(xiàn)大量黑色結(jié)晶，而無法保留黃色。