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IP(protein A/G磁珠)實(shí)驗常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案

2022-06-20
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免疫沉淀(IP)是一種可以純化和富集目標蛋白的沉淀技術(shù),在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中可用于識別蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用。免疫沉淀是一種重要的技術(shù),用于研究蛋白質(zhì)之間的存在、相對豐度、大小、上調或下調、穩定性、翻譯后修飾(PTMs)以及相互作用。以下為免疫沉淀實(shí)驗常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案,希望對大家的實(shí)驗有幫助。

一、背景高

  1. 樣本中有不溶蛋白殘留,離心后應立即取出上清。

  2. 洗滌不充分,優(yōu)化洗滌緩沖液,通過(guò)向洗滌緩沖液中加入去垢劑(0.5-1%NP-40/Triton X-100/Tween-20)、增加鹽離子濃度(如250mM NaCl/1-2mM DTT/β-ME),增加洗滌時(shí)間和次數來(lái)提高洗雜效率。

  3. 有非特異蛋白和磁珠結合,磁珠用BSA預封閉不充分,確保BSA新鮮,將磁珠和1%BSA 孵育1小時(shí),使用前PBS洗滌3-4次。

  4. 抗體特異性不好,使用親和純化,特異性好的抗體。

  5. 抗體用量太多導致非特異結合,嘗試使用更少的抗體。

  6. 裂解液中蛋白含量太高,導致洗滌液有很多假陽(yáng)性蛋白,減少樣本用量。

  7. 蛋白和抗體非特異結合,可以在免疫沉淀之前預先將磁珠和樣本孵育,清理樣本中可以和磁珠結合的成分,一些研究人員也使用同型對照來(lái)預清理裂解液。

  8. 樣本中目的蛋白降解,樣本裂解時(shí)嚴格低溫操作,加入過(guò)量蛋白酶抑制劑。

  9. 高強度洗脫緩沖液(如SDS-PAGE上樣緩沖液)將導致多種非特異蛋白和抗原一起洗脫,溫和的緩沖液(如0.1M甘氨酸,pH2.5)可防止此類(lèi)污染。

二、大量抗體被洗脫

抗體用量太高,嘗試減少抗體用量

三、沒(méi)有檢測到目的蛋白洗脫

  1. 樣本中目的蛋白不表達或低水平表達,如果表達水平低,需要增加裂解液用量,但也可能導致非特異結合的增加,所以在免疫沉淀之前需要預先清除裂解液。

  2. 抗體用量不夠,檢查抗體用量,提高使用量。

  3. 目標蛋白沒(méi)有從磁珠上洗脫,需要確保使用的洗脫緩沖液正確。

  4. 抗體沒(méi)有結合磁珠,確保使用的磁珠和抗體亞型匹配,磁珠正確保存,防止變質(zhì)或干燥。

  5. 裂解液中鹽堿度太高,需要改用低鹽堿度裂解液。一般可選NP-40, RIPA, western及IP細胞裂解液。

四、加樣順序對靶蛋白得率的影響

磁珠、抗體、抗原樣本混合一起孵育,速度最快,但靶蛋白純度和得率會(huì )很低。

間接法是抗體和抗原樣本先結合,再加入磁珠孵育,靶蛋白得率最高,直接法是磁珠先和抗體結合,再加入抗原孵育,對于表達豐度高的蛋白,兩種方法差別不大,如果表達豐度低,要選擇間接法獲得更高的靶蛋白得率。

五、抗原洗脫方法的選擇

  1. 變性洗脫法:如果后續進(jìn)行WB分析,可用此法十分高效,但洗脫下來(lái)的蛋白沒(méi)有生物活性。

  2. 酸性洗脫法:如果要對洗脫后蛋白進(jìn)行功能分析,則用酸性洗脫法,0.1-0.15M甘氨酸(pH2.5-3)是最高效的非變性洗脫液。

  3. 競爭洗脫法:如果靶蛋白帶有標簽,可用高濃度標簽或配體進(jìn)行競爭性洗脫,洗脫后樣本具有生物活性,且沒(méi)有抗體片段污染。

六、陽(yáng)性和陰性對照如何設置

陽(yáng)性對照:就是常說(shuō)的input,可直接用細胞裂解液或提取好的蛋白進(jìn)行WB,確定樣本中目的蛋白的存在。

陰性對照:如用同型對照作為陰性對照,來(lái)排除非特異結合的情況。

七、二抗如何選擇

IP捕獲抗體WB檢測一抗WB檢測二抗備注
小鼠來(lái)源小鼠來(lái)源HRP- protein A或HRP-抗小鼠IgGWB一抗若為mouse IgG1/IgG3亞型,HRP-標記Protein A親和力較低,可適當降低其稀釋度(也可先嘗試HRP-抗小鼠IgG二抗); WB一抗若為小鼠IgM/gA亞型,則避免選擇HRP- ProteinA,因其不結合。
兔來(lái)源HRP抗兔IgG
兔來(lái)源小鼠來(lái)源HRP抗小鼠IgG
兔來(lái)源HRP- protein A或HRP-抗兔IgG輕鏈特異性抗體HRP-Protein A可以有效降低重鏈信號以及消減輕鏈信號的影響,背景干凈,適用于檢測目的蛋白大小除45-55kDa之外的所有目的蛋白,而目的蛋白大小在45-55kDa之間時(shí),推薦使用HRP標記抗兔IgG輕鏈特異性二抗。


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