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如何選擇高質(zhì)量ELISA試劑盒

2022-06-20
424次

酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)是指將可溶性的抗原或抗體吸附到聚苯乙烯等固相載體上,進(jìn)行免疫反應從而對液體生物標本中微量物質(zhì)進(jìn)行測定的定性和定量方法。

檢測原理

1、使抗原或抗體結合到某種固相載體表面,并保持其免疫活性。

2、使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體,這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性,又保留酶的活性。在測定時(shí),把受檢標本(測定其中的抗體或抗原)和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質(zhì)分開(kāi),最后結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入反應底物后,底物被酶催化轉化為有色產(chǎn)物,產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān),故可根據顏色反應的深淺進(jìn)行定性或定量分析。

ELISA檢測具有靈敏度高、特異性強、操作簡(jiǎn)單、樣本量少等特色,且檢測結果準確度高,重復性好,在臨床及科研的抗原抗體檢測及病原體檢測方面得到了廣泛的使用。目前市面上ELISA試劑盒品牌駁雜,檢測指標種類(lèi)、別名繁多,產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊,我們應該怎么挑選適用的ELISA試劑盒產(chǎn)品呢?有哪些指標是需要我們考慮的呢?

首先,客戶(hù)需要明確實(shí)驗目的是做靶標功能性測定還是含量檢測。功能性測定一般是酶及底物的反應,對生物活性的分析。而Elisa專(zhuān)用于靶標分子的含量檢測。

其次,如果所研究指標為蛋白質(zhì)或多肽,可以到Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org/)查詢(xún)對應的的Uniprot ID,在選擇產(chǎn)品時(shí)同時(shí)核對指標名和Uniprot ID;如果所研究指標為小分子半抗原,此類(lèi)化學(xué)物質(zhì)可以到ChemSpider化學(xué)品庫(http://www.chemspider.com)查詢(xún)對應的CAS號,結合CAS號選擇需要的產(chǎn)品。

  然后,我們還需要根據已有文獻查詢(xún)或預判靶標在生物樣本中的有無(wú)或含量區間,針對性選擇靈敏度足夠的試劑盒,同時(shí)和廠(chǎng)商確認試劑盒的適用樣本是否包含客戶(hù)自己的實(shí)驗樣本。

  在此基礎上,如果客戶(hù)有多種品牌的同類(lèi)產(chǎn)品可以選擇,還應比較試劑盒產(chǎn)品的多項性能參數,包括靈敏度、特異性、精密性、準確度、線(xiàn)性、穩定性、天然樣本數據。這些參數是ELISA作為一種人為建立的微量分析方法為確保其有效性和可信度所必須考量的內在固有的特性。

1、靈敏度(sensitivity)試劑盒對于被檢物質(zhì)的最低檢測能力,如果我們待檢物質(zhì)濃度量很低,可以選擇高靈敏的試劑盒。靈敏度取值為空白對照的標準差對應的濃度值的3倍。

FineTest擁有獨特的信號放大專(zhuān)利技術(shù),能靈活調整試劑盒的靈敏度,最高可將靈敏度提高到fg級別,并有能力提高客戶(hù)樣品檢出率。

2、特異性(Specificity)判斷其他分子與試劑盒抗體的結合能力。交叉反應越小,試劑盒的特異性越好。一般需要衡量試劑盒與當前種屬同家族蛋白和其它種屬該蛋白、血清中常見(jiàn)因子(如異嗜性抗體、類(lèi)風(fēng)濕性因子等)、靶蛋白互作蛋白無(wú)交叉反應。為保證試劑盒特異性,FineTest主要有這3方面的努力:

2.1、從原料上精選單克隆抗體和多克隆抗體對;

2.2、從反應溶液體系上優(yōu)化包被緩沖液、樣本稀釋液和抗體稀釋液來(lái)抵抗基質(zhì)效應;

2.3、從測定物本身特性?xún)?yōu)化,天然抗原和重組蛋白抗原與捕獲抗體結合力的強弱由于結合后蛋白構象的改變而不同進(jìn)而會(huì )影響檢測值的區別。

3、精密性(Precision)也叫重復性,是對同一樣品重復測定時(shí)誤差大小的評估參數。一般要求板間及板內精密性控制在10%以?xún)取?/span>

FineTest使用全機器生產(chǎn),排除人工的不穩定性,依靠電子移液槍和自動(dòng)包板機精確加樣,嚴格控制批內差批間差。

4、準確度(Recovery ) 一般通過(guò)加標(spike-in)回收率來(lái)衡量,回收率在80%-120%之間為合格。通過(guò)添加標準品到天然樣本機制內進(jìn)行測定,以不添加標準品的天然樣本基質(zhì)為空白對照,回收率數值為靶標的測定濃度與添加的標準品濃度比值,以百分比計?;厥章势呋蚱蜁?huì )產(chǎn)生假陽(yáng)性或假陰性結果,影響測定值的準確性。

Matix

Recovery Range (%)

Average (%)

Serum(n=5)

85-98

93

EDTA Plasma(n=5)

88-100

95

Heparin Plasma(n=5)

86-98

93

5、線(xiàn)性度(Linearity ) 在天然樣本基質(zhì)中添加有適當濃度的標準品,分別稀釋2倍、4倍、8倍來(lái)檢測,測定各濃度下的回收率,回收率在80%-120%之間為合格。

Sample

1:2

1:4

1:8

Serum(n=5)

82-98%

84-100%

82-100%

EDTA Plasma(n=5)

80-104%

90-102%

86-97%

Heparin Plasma(n=5)

82-95%

83-98%

84-100%

6、穩定性(Stability ) 一般以加速破壞性實(shí)驗進(jìn)行驗證,將未拆封的試劑盒在37℃2-8℃分別放置一定時(shí)間,考察各項性能指標的偏差,以偏差小于10%為合格。穩定性越好,試劑盒存儲時(shí)間越長(cháng)。

FineTest自主開(kāi)發(fā)的穩定系統可以讓試劑盒在40度的環(huán)境下存放一周,活性不低于95%。大部分試劑盒可以在4度存放兩年活性依然能保持85-95%?;静挥绊懺噭┖泄ぷ骱徒Y果的準確性。

7、天然樣本檢測

  最后,還應明確試劑盒可以檢測天然樣本及合適的樣本類(lèi)型。根據靶點(diǎn)性質(zhì)預判適合檢測的樣本,并實(shí)際檢測該類(lèi)樣本數量達到5例以上,在客戶(hù)需要時(shí)提供一定的樣本含量數據參考。在市場(chǎng)上,根據國內外各大科研院所科研人員和行業(yè)內廣大廠(chǎng)家的共識,ELISA試劑盒通常被分為低端、中端和高端三類(lèi),一般也是用這七項性能參數來(lái)區分的。優(yōu)秀的ELISA試劑盒產(chǎn)品將極大地促進(jìn)我們實(shí)驗進(jìn)度,幫助我們拿到珍貴可靠的實(shí)驗數據。